蛋白酶體在真核生物和古菌中普遍存在，在一些原核生物中也存在。在真核生物中，它位於細胞核和細胞質中。[1] 能夠發揮這一作用的酶被稱為蛋白酶。蛋白酶體是細胞用來調控特定蛋白質的濃度和除去錯誤摺疊蛋白質的主要機制。經過蛋白酶體的降解，蛋白質被切割為約7-8個胺基酸長的肽段；這些肽段可以被進一步降解為單個胺基酸分子，然後被用於合成新的蛋白質[2]。
反應過程[編輯]
需要被降解的蛋白質會先被一個稱為泛素的小型蛋白質所標記（即連接上）。這一標記反應是被泛素連接酶所催化。一旦一個蛋白質被標記上一個泛素分子，就會引發其它連接酶加上更多的泛素分子；這就形成了可以與蛋白酶體結合的「多泛素鏈」，從而將蛋白酶體帶到這一標記的蛋白質上，開始其降解過程[2]。
分子結構[編輯]
從蛋白質結構上看，蛋白酶體是一個桶狀的複合物[3]，包括一個由四個堆積在一起的環所組成的「核心」（右圖中藍色部分），核心中空，形成一個空腔。其中，每一個環由七個蛋白質分子組成。中間的兩個環各由七個β亞基組成，並含有六個蛋白酶的活性位點。這些位點位於環的內表面，所以蛋白質必須進入到蛋白酶體的「空腔」中才能夠被降解。外部的兩個環各含有七個α亞基，可以發揮「門」的作用，是蛋白質進入「空腔」中的必由之路。這些α亞基，或者說「門」，是由結合在它們上的「帽」狀結構（即調節顆粒，右圖中紅色部分）進行控制；調節顆粒可以識別連接在蛋白質上的多泛素鏈標籤，並啟動降解過程。包括泛素化和蛋白酶體降解的整個系統被稱為「泛素-蛋白酶體系統」。
作用[編輯]
蛋白酶體降解途徑對於許多細胞進程，包括細胞周期、基因表現的調控、氧化應激反應等，都是必不可少的。2004年諾貝爾化學獎的獲獎主題就是蛋白質酶解在細胞中的重要性和泛素在酶解途徑的作用，而三位獲獎者為阿龍·切哈諾沃、阿夫拉姆·赫什科和歐文·羅斯。[4]
發現[編輯]
在發現泛素-蛋白酶體系統之前，細胞中的蛋白質降解被認為主要依賴於溶酶體，一種膜包裹的囊狀細胞器，內部為酸性環境且充滿了蛋白酶，可以降解並回收外源蛋白質以及衰老或損傷的細胞器。[2] 然而，在對網織紅血球的研究中發現，在缺少溶酶體的情況下，ATP依賴的蛋白質降解依然能夠發生；這一結果提示，細胞中存在另一種蛋白質降解機制。1978年，一些研究者發現這一新的降解機制有多種不同的蛋白質參與，在當時被認為是新的蛋白酶。[5] 隨後在對組織蛋白修飾的研究工作中發現，組織蛋白發生了意外的共價修飾：組織蛋白上的一個賴胺酸殘基與泛素蛋白C-端的甘胺酸殘基之間形成了共價連接，但其對應的功能未知。[6] 而後又發現先前鑒定的一個參與新的降解機制的蛋白質，ATP依賴的蛋白質水解因子1（ATP-dependent proteolysis factor 1，APF-1），實際上就是泛素。[7]
這些早期的工作導致了1970年代末和1980年代初，泛素-蛋白酶體系統在以色列技術工程學院（Technion – Israel Institute of Technology）阿夫拉姆·赫什科的實驗室中發現，而阿龍·切哈諾沃是當時實驗室中的一名研究生。正是在福克斯詹士癌症中心（Fox Chase Cancer Center）歐文·羅斯的實驗室做訪問研究期間，赫什科提出了關鍵的概念性想法，而羅斯後來並沒有對自己在其中的貢獻加以強調。[8] 由於他們在發現泛素-蛋白酶體系統上的貢獻，這三人一起分享了2004年度的諾貝爾化學獎。[4]
雖然1980年代中期，已經有電子顯微學資料顯示蛋白酶體的堆積環結構[9]，但直到1994年，第一個蛋白酶體核心顆粒的原子解析度結構才通過X射線晶體學獲得解析。[10] 至2000年，研究者用酵母中的20S核心顆粒與錐蟲的11S調節顆粒構造了異源蛋白酶體複合物，並解析了這一複合物的結構。[3] 但截止至2007年，還沒有獲得核心顆粒與真核生物中更為常見的19S調節顆粒的蛋白酶體複合物結構。
結構和組成[編輯]
蛋白酶體的組分通常根據它們的斯維德伯格沉降係數（以「S」來標記）來命名。最普遍的蛋白酶體的形式是26S蛋白酶體，其分子量約為2000kDa，包含有一個20S核心顆粒和兩個19S調節顆粒。核心顆粒為中空結構，將剪切蛋白質的活性位點圍在「洞」中；將核心顆粒的兩端敞開，目的蛋白質就可以進入「洞」中。核心顆粒的每一端都連接著一個19S調節顆粒，每個調節顆粒都含有多個ATP酶活性位點和泛素結合位點；調節顆粒可以識別多泛素化的蛋白質，並將它們傳送到核心顆粒中。除了19S調節顆粒外，還存在另一種調節顆粒，即11S顆粒；11S調節顆粒可以以類似於19S顆粒的方式與核心顆粒結合；11S顆粒可能在降解外源肽（如病毒感染後產生的肽段）上發揮作用。[11] 此外，PA200（酵母中為Blm10）蛋白也可以單獨作為激活蛋白來調控20S顆粒的開啟。
20S核心顆粒[編輯]
不同的生物體中，20S核心顆粒中亞基的數量和差異性都有所不同；就亞基數量而言，多細胞生物比單細胞生物要多，真核生物比原核生物多。所有的20S顆粒都由四個堆積的七元環所組成，這些環結構則是由兩種不同的亞基構成：α亞基為結構性蛋白，而β亞基則發揮主要的催化作用。外部的兩個環，每個環都含有七個α亞基，一方面作為調節顆粒的結合部，另一方面發揮「門」的作用，阻止蛋白質不受調控地進入核心顆粒的內部。內部的兩個環，每個環都含有七個β亞基，且包含蛋白酶活性位點，用於蛋白質水解反應。蛋白酶體的大小在不同物種之間相當保守，其長和寬分別為約150 Å和115 Å。其內部孔道寬為近53 Å，而入口處則只有13 Å的寬度，這就提示蛋白質要進入其中，需要先被至少部分去摺疊。[12]
在古菌（如Thermoplasma acidophilum）中，所有的α亞基和所有的β亞基是等同的；而真核生物的蛋白酶體（如酵母）中，每個亞基都不相同，即α和β亞基都含有七種不同的亞基。在哺乳動物中，β1、β2和β5亞基具有催化作用；雖然它們有著共同的催化機制，但它們具有不同的受質特異性，分別為類胰凝乳蛋白酶型、類胰蛋白酶型和肽谷氨醯基肽水解。[13] 在暴露於前炎症信號（如細胞因子，特別是γ干擾素）時，細胞應激反應會促使造血細胞表現另一些形式的β亞基，即β1i、β2i和β5i。由這些替代亞基所組裝成的蛋白酶體又被稱為「免疫蛋白酶體」（immunoproteasome），相對於正常形式的蛋白酶體，其受質特異性發生了變化。[12]
19S調節顆粒[編輯]
真核生物中的19S顆粒是由19個蛋白質組成的，並可以被分成兩個部分：一個由10個蛋白質組成的可以與20S核心顆粒上的α環直接結合的基底，和一個由9個蛋白質組成的結合多泛素鏈的蓋子。其中，10個基底蛋白質中的6個具有ATP酶活性。19S和20S顆粒的結合需要ATP先結合到19S顆粒上的ATP結合位點。[14] ATP的水解對於蛋白酶體降解一個連接泛素的緊密摺疊的蛋白質是必不可少的，而ATP水解所產生的能量主要是用於蛋白質的去摺疊[15]、核心顆粒的孔道開放[16] 還是兩者皆有[14]，則還不清楚。截止到2006年，26S蛋白酶體的結構還沒有獲得解析。[16]
19S顆粒的每個組分都有它們自己的調控作用。一個近期鑒定出的癌蛋白Gankyrin是19S顆粒的組分之一，可以與細胞周期蛋白依賴性激酶CDK4緊密結合，並且通過與泛素連接酶MDM2的結合，在識別泛素化的P53蛋白中發揮作用。Gankyrin具有抗凋亡作用，其被發現在一些類型的腫瘤細胞（如肝癌細胞）中過表現。[17]
11S調節顆粒[編輯]
20S核心顆粒也可以與第二種調節顆粒，即11S顆粒相結合。11S調節顆粒又被稱為PA28或REG。它是七聚體結構，不包含任何ATP酶，能夠促進短肽而不是完整的蛋白質的降解。這可能是因為由11S顆粒與核心顆粒所組成的複合物無法將大的受質去摺疊。11S顆粒的調控機制與19S顆粒的機制類似，是通過其亞基的C末端結合核心顆粒，並誘發α環發生構象變化，從而打開20S核心顆粒的「門」，使得受質蛋白質可以進入核心顆粒。[18] 11S顆粒的表現受γ干擾素的誘導，並且負責與免疫蛋白酶體的β亞基一起生成結合到主要組織相容性複合體上的肽段。[11]
PA200/Blm10[編輯]
11S和19S調節顆粒都是多亞基的複合物，而實際上真核生物中還存在著以單個蛋白結合20S顆粒的調節蛋白──PA200或Blm10（酵母中）。PA200的分子量高達200kDa，其主要定位於細胞核中，可以直接結合併激活20S顆粒。[19][20] PA200可能參與了DNA雙鏈斷裂的修復。[20]
組裝機制[編輯]
蛋白酶體的組裝是一個十分複雜的過程，這是因為必須將所有的數量眾多的亞基正確地結合到一起才能形成一個有活性的核心顆粒複合物。β亞基被合成後，其N末端帶有「前肽」（propeptide）；在組裝20S顆粒的過程中，「前肽」通過轉譯後修飾作用以暴露出活性位點。整個組裝過程雖然複雜，卻也十分有序。首先，將α亞基組裝為七元環，為對應的前β環提供模板，然後完成前β環的組裝，這樣一個七亞基的前β環和一個七亞基的α環就形成了半個核心顆粒。對於α環的組裝機制，目前還沒有定論。[21] 接著，兩個半個核心顆粒之間的兩個β環相結合，並觸發蘇胺酸依賴的「前肽」的自降解，從而暴露出活性位點，這就組裝成了一個有活性的20S核心顆粒。β環之間的這種相互作用主要是由保守的α螺旋殘基之間的鹽橋和疏水相互作用來介導的；而通過突變這些保守殘基，可以破壞蛋白酶體的組裝，從而從另一方面證實了這些殘基對於組裝的重要性。[22]
對於19S調節顆粒的組裝和成熟過程的了解較少。目前的看法認為19S調節顆粒是由兩個不同的部分，即含ATP酶的基底部分和泛素識別的蓋子部分組裝而成。其中，基底部分中的六個ATP酶可以通過捲曲螺旋的相互作用以配對的方式結合在一起。[23] 調節顆粒中19個亞基的這樣的組裝順序很可能是一種調控機制，用於阻止在組裝完成之前將活性位點暴露出來。[16]
蛋白質降解過程[編輯]
步驟1：泛素化和定靶[編輯]
需要被蛋白酶體降解的蛋白質會先被連接上泛素作為標記，即蛋白質上的一個賴胺酸與泛素之間形成共價連接。這一過程是一個三酶級聯反應，即需要有由三個酶催化的一系列反應的發生，整個過程被稱為泛素化信號通路。在第一步反應中，泛素活化酶（又被稱為E1）水解ATP並將一個泛素分子腺苷酸化。接著，泛素被轉移到E1的活性中心的半胱胺酸殘基上，並伴隨著第二個泛素分子的腺苷酸化。[24] 被腺苷酸化的泛素分子接著被轉移到第二個酶，泛素交聯酶（E2）的半胱胺酸殘基上。最後，高度保守的泛素連接酶（E3）家族中的一員（根據受質蛋白質的不同而不同）識別特定的需要被泛素化的靶蛋白，並催化泛素分子從E2上轉移到靶蛋白上。靶蛋白在被蛋白酶體識別之前，必須被標記上至少四個泛素單體分子（以多泛素鏈的形式）。[25] 因此，是E3使得這一系統具有了受質特異性。[26] E1、E2和E3蛋白的數量依賴於生物體和細胞類型，人體中就存在大量不同的E3蛋白，這說明泛素-蛋白酶體系統可以作用於數量巨大的靶蛋白。
多泛素化後的蛋白質是如何被蛋白酶體所識別的，還沒有完全弄清。泛素受體蛋白的N末端具有一個類泛素結構域，以及一至多個泛素結合結構域。類泛素結構域可以被19S調節顆粒所識別，而泛素結合結構域可以通過形成三螺旋束來結合泛素。這些受體蛋白可能能夠結合多泛素化的蛋白質並將其攜帶到蛋白酶體，而關於這種結合的特異性和調控機制還不清楚。[27] 但最近有研究者發現，調節顆粒上的亞基Rpn13可以發揮泛素受體的功能。[28][29]
泛素蛋白自身由76個殘基所組成，以「泛素」為名是因為它在生物體中廣泛存在：具有高度保守的序列並且存在於所有已知的真核生物體中。真核生物中編碼泛素的基因以串聯重複的方式排列，這可能是因為大量轉錄的需要，為細胞生產足夠多的泛素。有人提出泛素是目前發現的進化速度最慢的蛋白質。[30]
步驟2：去摺疊和移位[編輯]
泛素化後的蛋白質（以下稱為受質蛋白）被19S調節顆粒所識別，這一過程是一個ATP依賴的結合過程。[14] 然後，受質蛋白必須進入20S核心顆粒的內部孔道，以便與位於其中的水解活性位點接觸。由於20S顆粒的孔道相對狹窄，而且兩端由α環中亞基的N末端控制開關，所以受質蛋白在進入核心顆粒之前必須至少部分去摺疊。將去摺疊的蛋白質傳遞進入核心顆粒的過程被稱為「移位」（translocation），而移位必須發生在去泛素化之後。[14] 但目前對於受質蛋白的去泛素化和去摺疊機制還不了解。[31] 在整個降解反應過程中，那一步是限速步取決於受質蛋白的類別；對於一些蛋白質，去摺疊過程是限速步，而對於另一些蛋白質，可能是去泛素化為限速因子。[15] 至於哪些受質蛋白在移位之前必須去摺疊，還未有結論，而牢固的三級結構和一些特殊的非局部相互作用，如二硫鍵，能夠抑制降解。[32]
由α亞基所形成的「門」可以阻止長於四個殘基的多肽進入20S顆粒的內部。在識別步驟開始前結合上的ATP分子在移位發生前被水解，而對於水解產生的能量是用於蛋白質去摺疊[15] 還是「門」的打開[16] 還有爭議。26S蛋白酶體在存在無法水解的ATP類似物（即無法獲得水解產生的能量）的情況下，依然可以降解去摺疊的蛋白質，但卻無法降解摺疊的蛋白質；這一結果說明ATP水解所產生的能量至少部分被用於蛋白質去摺疊。[33] 在19S帽子處於ATP結合狀態時，去摺疊的受質蛋白可以由促進擴散作用，傳遞通過開啟的「門」。[34]
球蛋白去摺疊的機制是基本類似的，但在一定程度上也取決於蛋白質的胺基酸序列。研究者發現含有較長的甘胺酸或丙胺酸序列可以抑制去摺疊，從而降低蛋白酶體的降解效率；其結果是生成含有部分去摺疊蛋白質的混合物，這可能是由於ATP水解和去摺疊步驟之間的脫節所導致的。[35] 自然界中的一些蛋白質也有這樣的甘胺酸-丙胺酸重複序列存在，如蠶絲中的絲心蛋白；值得一提的是，特定的人類皰疹病毒基因的表現產物也含有這樣的序列，通過抑制蛋白酶體的作用，阻止了抗原呈遞到主要組織相容性複合體上，從而有助於病毒的繁殖。[36]
步驟3：蛋白質的降解[編輯]
蛋白質的降解由20S核心顆粒中的β亞基進行，其機制被認為是蘇胺酸依賴的親核攻擊。這一機制可能需要有一個結合的水分子參與活性的蘇胺酸上羥基的去質子化。降解發生在核心顆粒中間的兩個β環內的孔道裡，一般不生成部分降解的產物，而是將受質蛋白完全降解為長度一定的肽段；肽段的長度一般為7-9個殘基，但根據生物體和受質蛋白的不同，長度範圍可以從4-25個殘基不等。決定分解產物中肽段長度的機制，目前還沒有完全弄清。[37] 雖然具有催化活性的三個β亞基具有共同的降解機制，但它們對於受質的特異性卻略有不同，分別為類胰凝乳蛋白酶型、類胰蛋白酶型和肽谷氨醯基肽水解型。這種對於受質特異性的差異是來自於靠近活性位點的局部殘基與受質之間的相互作用的不同。每一個具有催化活性的β亞基也都含有一個降解所必需的保守的賴胺酸。[13]
雖然蛋白酶體通常生成非常短的降解片斷，但在一些情況下，這些降解產物自身是具有生物學活性的功能分子。特定的轉錄因子，包括哺乳動物的NF-κB複合物中的一個組分，合成後是以無活性的前體分子存在，在經過泛素化和蛋白酶降解後，才轉變為活性分子。這種降解需要蛋白酶體剪切蛋白質的中間部分，而不是通常情況下的從蛋白質的一端開始的剪切。有人提出，需要被剪切的中間部分為一個長的環，位於蛋白表面，從而可以作為蛋白酶體的受質進入其內部孔道，而蛋白質的其他部分依然在孔道外，並不會被降解。[38] 在酵母蛋白中也發現了類似的現象；這種選擇性降解被稱為「受調控的泛素-蛋白酶體依賴的剪切
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